In this thesis, we have analysed the effects of EE2 on non-reproductive behaviours and fertility. We have showed that two doses of EE2 in male adult short-term exposures evokes opposite behaviours in the novel tank test. A lower dose induced increased bottom-dwelling, a sign of increased anxiety and a higher dose increased surface-dwelling, which would likely expose themselves to predation in a natural environment. Increased shoaling was observed in both exposures, possibly affecting feeding and reproduction opportunities. Fertility analysis of these fish demonstrated a complete inhibition of spawning in the highest dose group. To investigate mechanisms behind the spawning failure, we examined expression levels of genes involved in zebrafish sex differentiation and maintenance of gonadal function. We found downregulated transcription levels of male-predominant genes, suggesting a demasculinization of the testes contributing to functional sterility in these fish. We have demonstrated that non-reproductive behaviour in zebrafish is highly sensitive to EE2 exposure during development. After exposing male and female zebrafish to low doses of EE2 followed by remediation in clean water until adulthood, the fish displayed increased anxiety and shoaling behaviour, demonstrating persistent effects of EE2. Furthermore, behavioural effects were transferred to their progeny. Decreased fertilisation success of the developmentally exposed fish was observed in both sexes when mated to untreated animals of the opposite sex. These fertility effects persisted although the fish had a long remediation period, implying likely reduced fitness of fish populations in aquatic environments. Based on our findings on non-reproductive behaviours and fertility, we performed RNAsequencing analysis of the brain and testes in order to investigate possible biological mechanisms behind the persistent effects. There is a need for biomarkers allowing detection of both reversible and irreversible effects in animals exposed to estrogenic substances, hopefully contributing to better risk assessments for EDCs. Results from RNA-sequencing would serve as a basis for continued studies in pursuit of potential biomarkers.

Aquatic environments are the end recipient for most anthropogenic chemical pollutants. One common chemical pollutant found in the aquatic environment is 17α-ethinylestradiol (EE₂), a synthetic estrogen used in contraceptive pills. EE₂ is found in sewage treatment plant effluents and surface waters in concentrations from non-detectable up to 300 ng/L. EE₂ has the ability to bioaccumulate and is more than 10 fold more potent in fish than the natural counterpart estradiol. Exposure has led to skewed sex ratios, decreased egg and sperm production, and altered reproductive behavior.  The aim of this thesis was to investigate the effects of EE₂ exposure on non-reproductive behavior and fertility in fish. We found that zebra fish exposed to low concentrations of EE₂ during development showed increased anxiety-like behavior and decreased fertility that were persistent in adulthood, even after a long remediation period in clean water. The altered behavior and lowered fertility were accompanied by alterations in the testis and brain transcriptome of possible significance for the behavior and fertility effects. The zebrafish was also used in adult exposures of EE₂ and citalopram, alone and in combination to investigate if behavioral effects can be detected at very low concentrations, and if so, if the two compounds would interact and affect the behavioral outcome. Anxiety-like behavior was altered by EE₂ and the two compounds in combination affected the outcome of each other. Further, when developmental exposure of progeny to wild caught three spined stickleback was used as a link between laboratory fish and natural fish populations, EE₂ was found to decrease the anxiety-like behavior in the adult stickleback as well as cause ovotestis and intersex, feminization and sex reversal of genetic males. In conclusion, fertility and non-reproductive behaviors in the zebrafish and three spined stickleback are sensitive to EE₂ exposure and effects from developmental exposures seem to be persistent.  Fertility and behavior are of high ecological significance for fish and alterations due to EE₂ exposure might have negative effects on population fitness. The persistent alterations in the transcriptome of the zebrafish testis and brain lead to generation of hypotheses of mechanisms involved in the behavior and reproductive phenotypes caused by developmental exposure to EE₂.

Den akvatiska miljön är ofta särskilt utsatt för miljöföroreningar då de flesta ämnen förr eller senare sprids dit genom bland annat markavrinning, nedfall från luften och/eller från vattenreningsverk. Syntetiskt östrogen som används i p-piller, 17α-etinylestradiol (EE₂), sprider sig ofta till vattenmiljön från avloppsvatten, då det bara delvis renas bort i vattenreningsprocessen. EE₂ är ett hormonstörande ämne med förmågan att ansamlas i organismer och mer än tio gånger så verksamt i fisk som det naturliga hormonet estradiol (E₂). Man har tidigare sett att exponering för EE₂ även i de låga halter som påvisas vid vattenreningsverk bland annat har lett till minskade produktion av ägg och spermier samt förändrade parningsbeteenden.

I denna avhandling undersöks effekterna av EE₂ på fiskars icke-reproduktiva beteende och fertilitet. Dessa faktorer är av hög ekologisk relevans för fisk då förändringar på dessa kan ge negativa effekter på populationsnivå. Resultaten visar att zebrafisk som exponeras för låga halter av EE₂ under utvecklingen uppvisar ett mer ängsligt beteende och har lägre fertilitet när de blir vuxna även efter en lång återhämtningsperiod i rent vatten. Det förändrade beteendet uppvisas även hos avkomman till dessa fiskar.  Förändringarna i beteende och fertilitet åtföljdes av förändringar i hjärnans och testikelvävnadens transkriptom, dvs. förändringar i vilka gener som uttrycks. I zebrafiskens testikelvävnad hittades bland annat en skillnad i uttryck av gener kopplade till könsdifferentiering och utveckling samt spermatogenesen, gener som kan ha betydelse för den nedsatta fertiliteten. I zebrafiskens hjärna hittades ingen skillnad i uttryck på gener direkt kopplade till stressaxeln men däremot på flera andra gener i nätverk som indirekt kan kopplas till det ängsliga beteendet som dygnsrytm och kolesterolsyntes. I naturen exponeras organismer ofta för en blandning av föroreningar. Därför undersöktes också effekter av EE₂ i kombination med citalopram, ett antidepressivt läkemedel som ofta påvisas i vattenmiljön, för att undersöka om förändringar i beteende kan påvisas även vid väldigt låga koncentrationer av varje ämne och, om så är fallet, vilka effekter en kombination av de två ämnena ger. Vuxna zebrafiskar uppvisade beteendeförändringar även vid dessa låga koncentrationer efter två veckors exponering och de två ämnena påverkade beteendet olika var för sig och i kombination. Vidare, användes vildfångad storspigg i ett exponeringsexperiment för att undersöka om resultaten från zebrafisken, som är en avlad laboratoriefisk, kan ses också i vilda fiskpopulationer. Även storspiggar som exponerades för EE₂ under utveckling fick ett modifierat beteende samt en skev könsfördelning som vuxna: fler honor fanns hos de storspiggar som exponerats och vidare undersökningar visade att dessa var genetiska hanar som utvecklats som honor.

Den här avhandlingen visar beständiga förändringar i zebrafiskens transkriptom i hjärna och testikelvävnad efter exponering för EE₂ i låga halter under utveckling. Både icke-reproduktiva beteenden och fertilitet visade sig känsliga för EE₂ i såväl zebrafisk som storspigg och effekterna verkar vara permanenta. Sammanfattningsvis har EE₂ effekter på ekologiskt relevanta faktorer hos fisk i de halter som förekommer i vattenmiljön och hormonstörande föroreningar som EE₂ kan ge långvariga effekter som syns senare i livet även vid låga koncentrationer.